- 相關(guān)推薦
病毒宏基因組學(xué)方法優(yōu)缺點(diǎn)及意義
隨著時(shí)代的發(fā)展和生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,新興的病毒宏基因組學(xué)為解決這些問(wèn)題提供了契機(jī),以下是一篇關(guān)于病毒宏基因組學(xué)探究的論文范文,供大家閱讀參考。
病毒個(gè)體微小,多數(shù)病毒直徑在100nm(20~200nm),較大的病毒直徑300~450nm,較小僅為18~22nm,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,不能獨(dú)立復(fù)制需要依賴(lài)于宿主細(xì)胞復(fù)制繁殖,被許多生物學(xué)家認(rèn)為是處于生命和非生命交叉區(qū)域的存在物。據(jù)估計(jì)目前對(duì)病毒的發(fā)掘還不到1%[1],對(duì)病毒的研究具有廣闊的前景和現(xiàn)實(shí)意義。病毒獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和特性給病毒的研究和鑒別帶來(lái)許多困難,主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:第一,病毒沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的宿主細(xì)胞系,60%以上的病毒無(wú)法成功的進(jìn)行離體培養(yǎng)[2]或在培養(yǎng)中不能表達(dá)致病性;第二,病毒基因本身變異率高,通過(guò)與宿主間的相互作用進(jìn)化,增加核酸多樣性,產(chǎn)生新病毒,導(dǎo)致宿主范圍擴(kuò)大、跨物種傳播[3].對(duì)細(xì)菌的研究可以通過(guò)保守的16sRNA的分析來(lái)定位分類(lèi)信息、進(jìn)化關(guān)系和種群多樣性等。對(duì)于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像細(xì)菌真菌,沒(méi)有固定保守的進(jìn)化標(biāo)記基因。
所以一些傳統(tǒng)研究方法的應(yīng)用受到限制,不能完全滿(mǎn)足病毒研究的需要。如電鏡觀察病毒的靈敏性不高,細(xì)胞培養(yǎng)病毒可能觀察不到細(xì)胞病變,血清學(xué)反應(yīng)中不但難以獲得高價(jià)抗體而且容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果,傳統(tǒng)PCR方法對(duì)未知序列及高變異的病毒研究難以發(fā)揮作用。加之近年來(lái)病毒流行病的頻繁發(fā)生及其可怕的傳染性,對(duì)人類(lèi)及動(dòng)植物的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅,如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等,給人們?cè)斐闪司薮蟮目只藕徒?jīng)濟(jì)損失。因此,對(duì)病毒基因組的研究、致病源的探索、病毒在生物體和環(huán)境中如何存在及傳播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。
隨著時(shí)代的發(fā)展和生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,新興的病毒宏基因組學(xué)為解決這些問(wèn)題提供了契機(jī),宏基因組學(xué)(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出,對(duì)特定環(huán)境中基因組的總和進(jìn)行研究,包括培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物。病毒宏基因組學(xué)(Viral metagenomics)就是宏基因組學(xué)在病毒領(lǐng)域的應(yīng)用,即從環(huán)境或生物組織中濃縮病毒粒子的遺傳物質(zhì)進(jìn)行生物學(xué)信息分析的技術(shù)。它的應(yīng)用需要一些交叉學(xué)科的創(chuàng)新技術(shù)的支持,隨機(jī)引物PCR和新一代測(cè)序技術(shù)---高通量測(cè)序的應(yīng)用大大提高了研究的效率和獲取信息的豐度,克服大環(huán)境中病毒濃度低、易受干擾的不足,拓展了病毒宏基因組學(xué)的應(yīng)用范圍和現(xiàn)實(shí)作用,為探索未知病毒提供廣闊的前景和應(yīng)用空間。在人類(lèi)預(yù)防疾病、開(kāi)發(fā)疫苗方面具有重大貢獻(xiàn)。
1、病毒宏基因組學(xué)的研究過(guò)程
對(duì)于未知病毒的研究過(guò)程如下:SISPA方法是1991年Gregory和Jung在隨機(jī)引物PCR方法的基礎(chǔ)上創(chuàng)造的[6],SISPA-PCR使用含有已知片段的隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,這個(gè)已知片段在接下來(lái)的PCR反應(yīng)中將作為引物[7],此方法先后經(jīng)Breitbart[8]和Djikeng[9]等人的改進(jìn),在SISPA的基礎(chǔ)上建立了RNase、DNase-SISPA聯(lián)用的方法,增加了樣品過(guò)濾和DNA酶RNA酶消化等步驟,去除外源污染,發(fā)現(xiàn)新病毒。高通量測(cè)序(High-throughput se-quencing)也稱(chēng)第二代測(cè)序技術(shù)或深度測(cè)序[10],可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行同時(shí)測(cè)序,一次可同時(shí)輸出大量數(shù)據(jù),打破樣品類(lèi)型局限,最大限度的富集病毒核酸信息。
樣品通過(guò)離心、過(guò)濾、核酸酶處理等步驟去除病毒粒子以外的物質(zhì)和背景核酸的干擾[11],純化和富集病毒粒子,降低錯(cuò)配率,減少數(shù)據(jù)量,提高下游分析速率。所以此步驟的富集效果對(duì)后來(lái)的高通量測(cè)序結(jié)果的序列數(shù)量有決定性影響。將樣品中的病毒粒子富集到106個(gè)·mL-1以上為理想狀態(tài)[12].然后進(jìn)行核酸DNA和RNA的提取。
病毒基因組比真核和原核宿主短,在核酸制備過(guò)程中要盡量去除污染,一個(gè)小的污染可能導(dǎo)致長(zhǎng)基因優(yōu)先測(cè)序[13],掩蓋病毒基因,可能導(dǎo)致宏基因組分類(lèi)組成成分的偏差。選取幾種隨機(jī)單引物對(duì)提取的核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用Klenow酶合成cD-NA的第二條鏈,然后用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,增加樣品中低豐度病毒的檢出率。不同的隨機(jī)擴(kuò)增方法對(duì)不同的核酸類(lèi)型(線型、環(huán)形、ss/dsRNA/DNA)有不同的效率[14],應(yīng)用多種擴(kuò)增方法和引物可以?xún)?yōu)化檢測(cè)大環(huán)境中可能的病毒核酸的靈敏度,增加覆蓋率。產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè),電泳條帶呈現(xiàn)彌散狀,送生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生大量數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)的篩選處理和分析是整個(gè)過(guò)程的又一關(guān)鍵步驟,如果數(shù)據(jù)分析不好,整個(gè)實(shí)驗(yàn)就不能得到理想的效果,那么海量的測(cè)序數(shù)據(jù)也就失去了意義。
病毒宏基因組的分析流程與一般宏基因組數(shù)據(jù)分析流程相似,包括原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理、基因組裝、功能分類(lèi)和基因預(yù)測(cè)等。但病毒序列存在高變異性。測(cè)序序列中也可能存在原病毒的序列,原病毒以溶原態(tài)存在于宿主染色體內(nèi),這將會(huì)影響病毒基因組與宿主的分離[15].
對(duì)于發(fā)現(xiàn)新病毒可以將單個(gè)序列和contigs在blastn的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),如果比對(duì)結(jié)果無(wú)法判斷出是何種序列,則在blastx的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),比對(duì)的E值如果大于e-5則被認(rèn)為是目前無(wú)法確定的生物的基因序列。如果比對(duì)的結(jié)果小于e-5又與其最近的那一條的相似性較低,則可能是我們需要關(guān)注的目標(biāo)[3].
2、病毒宏基因組學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)和局限
2.1優(yōu)勢(shì)
傳統(tǒng)方法只能以已知病毒為目標(biāo),難以發(fā)現(xiàn)新病毒,而病毒宏基因組學(xué)方法結(jié)合新一代測(cè)序技術(shù)和隨機(jī)PCR1的病毒;研究的病毒直接從環(huán)境中獲取,不需要分離培養(yǎng);可以對(duì)環(huán)境中過(guò)于分散、豐度低的病毒進(jìn)行系統(tǒng)分析和鑒定。
2.2局限
應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法進(jìn)行研究,依然存在一些問(wèn)題需要進(jìn)一步探索,如從大量環(huán)境中提取樣本方式,隨機(jī)擴(kuò)增方法和引物的選擇能否做到無(wú)偏差覆蓋所有病毒,海量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理,依賴(lài)樣品復(fù)雜度的生物信息分析等。
3、病毒宏基因組學(xué)的應(yīng)用
病毒宏基因組學(xué)以其顯著的優(yōu)勢(shì)在病毒研究的各個(gè)方面得到廣泛應(yīng)用,如人類(lèi)、動(dòng)植物健康,水、環(huán)境問(wèn)題、病毒領(lǐng)域的研究等等。改變著人們對(duì)病毒的認(rèn)識(shí),給涉及病毒的許多問(wèn)題提供新的解決思路。
3.1臨床應(yīng)用
2008年[16]病毒宏基因組學(xué)在人體臨床檢查中第一次應(yīng)用,結(jié)合深度測(cè)序檢測(cè)器官移植相關(guān)的致死疾病的病原體。利用病毒宏基因組學(xué)對(duì)人體的唾液、呼吸道、血液、排泄物的檢測(cè)分析,可以發(fā)現(xiàn)未知和潛在的致病病毒。
Law等[17]對(duì)一些肝病患者的血漿進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)病毒宏基因組學(xué)方法快速準(zhǔn)確,還能將檢測(cè)范圍擴(kuò)大到其它體液。
單同領(lǐng)[18]根據(jù)病毒宏基因組學(xué)的方法分析了兒童和豬腸道病毒群落,并且確定了致病原的信息。
Zhang等[19]應(yīng)用宏基因組學(xué)在人的糞便中發(fā)現(xiàn)了大量的植物病毒。
Willner等[20]應(yīng)用宏基因組學(xué)分析了健康和呼吸道感染的人的呼吸道分泌物中的DNA病毒群落。
2010年[21]在沒(méi)有先驗(yàn)信息的條件下,應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)獲得了流感病毒的全部基因。研究者還通過(guò)監(jiān)測(cè)特定區(qū)域內(nèi)已知傳染人、動(dòng)植物病毒的昆蟲(chóng)媒介攜帶的病毒[22],來(lái)檢測(cè)相關(guān)病毒的流行和預(yù)防,為突發(fā)病原體的鑒定提供方向。蝙蝠作為很多人獸共患病(例如埃博拉病毒、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)病毒和尼帕病毒)的自然傳播宿主,故蝙蝠體內(nèi)的病毒多樣性成為學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
2010年,Li等[23]和Donaldson等[24]應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)的方法分別研究了北美蝙蝠糞便中的病毒群落。發(fā)現(xiàn)了大量新的哺乳動(dòng)物病毒、昆蟲(chóng)病毒和植物病毒,Donaldson還發(fā)現(xiàn)了一株新的冠狀病毒。
2013年,楊凡力等[25]應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)的方法研究吉林、云南、湖南采集的蝙蝠組1小雙節(jié)RNA病毒、圓環(huán)病毒等新病毒。
2000年用病毒宏基因組學(xué)方法對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行了鑒定[26].
3.2環(huán)境問(wèn)題
病毒能夠抵抗很多常規(guī)水處理系統(tǒng)在水中頑固存留,利用病毒宏基因組學(xué)快速檢測(cè)水環(huán)境中的病原體,得到的宏基因組數(shù)據(jù)可以作為排泄物污染的指標(biāo),以此檢測(cè)水質(zhì)量。
Rosario等[27]應(yīng)用宏基因組學(xué)在廢水處理廠的污水中發(fā)現(xiàn)了大量的來(lái)自動(dòng)植物和人的致病性病毒,從而認(rèn)為污水可能是病毒傳播的一種途徑。
3.3病毒研究
目前科學(xué)家正在發(fā)展功能病毒宏基因組學(xué),來(lái)發(fā)掘新病毒的功能酶[28],用于診斷和生物科學(xué)研究。利用病毒宏基因組學(xué)可以開(kāi)發(fā)不同環(huán)境中的各種病毒如海洋、溫泉、巖石層、地下和高溫環(huán)境等,為研究病毒學(xué)的分類(lèi)和進(jìn)化提供方法。
通過(guò)對(duì)環(huán)境病毒宏基因組學(xué)的研究,可以了解環(huán)境中病毒的有機(jī)構(gòu)成、進(jìn)化關(guān)系,進(jìn)而掌握病毒的分布、變化動(dòng)態(tài)和進(jìn)化情況,追蹤一些病原體的原始自然宿主,以便及時(shí)防控和預(yù)測(cè)一些常發(fā)和新發(fā)病毒病,還可以通過(guò)改變病變環(huán)境中的微生物群落來(lái)對(duì)抗病理性群落,從而達(dá)到改善病情甚至是治療的效果[29].
4、病毒宏基因組學(xué)的研究意義
病毒宏基因組學(xué)的應(yīng)用為病毒生態(tài)學(xué)在研究遺傳潛力、病毒群落組成和結(jié)構(gòu)以及環(huán)境病地理學(xué)等問(wèn)題提供廣闊的前景和方向。病毒宏基因組學(xué)還涉及了病毒和宿主之間的相互作用,病毒一些裸露在外的基因可能以某種未知的方式操控宿主,這對(duì)一些疾病的致病機(jī)理的分析、制定有效的治療方法具有重大意義。病毒宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)病毒的潛力能夠推動(dòng)許多相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,如進(jìn)化生物學(xué)、病原體的檢測(cè)和生物技術(shù)。
病毒宏基因組學(xué)對(duì)一定環(huán)境內(nèi)的全部病毒的研究起到了里程碑式的作用,此環(huán)境可以是海洋、土壤等無(wú)機(jī)環(huán)境,也可以是各種生物體的組織等有機(jī)環(huán)境。在病毒研究領(lǐng)域具有劃時(shí)代意義。
5、展望
隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,一些交叉學(xué)科創(chuàng)新技術(shù)的發(fā)現(xiàn),能夠更加完善病毒宏基因組學(xué)的研究體系,例如搭建更為豐富的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù),開(kāi)發(fā)病毒宏基因組學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的分析工具,將宏基因組學(xué)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)等技術(shù)結(jié)合起來(lái)在組學(xué)研究的多個(gè)層面上探索微生物的多樣性等,使此項(xiàng)技術(shù)能夠更廣泛更準(zhǔn)確的應(yīng)用于病毒相關(guān)領(lǐng)域。通過(guò)對(duì)人體內(nèi)微生物種群多樣性的研究來(lái)探索其與某些疾病、耐藥情況[30]的可能關(guān)系。此技術(shù)還可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)新的酶物質(zhì)、抗生素以及一些有用的次生代謝產(chǎn)物。地球上海洋面積約占總面積的72%,富含豐富的資源,利用宏基因組學(xué)對(duì)海洋微生物的開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。
期待未來(lái)的某一天能夠利用此技術(shù)攻克如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和埃博拉病毒等高傳染性、高致死率、嚴(yán)重威脅全人類(lèi)生命健康的病毒病。
【病毒宏基因組學(xué)方法優(yōu)缺點(diǎn)及意義】相關(guān)文章:
淺談?dòng)?jì)算機(jī)病毒的診斷和清除方法03-05
一種基于宏指令的數(shù)控加工進(jìn)度采集方法03-02
刑法方法論的中國(guó)意義03-05
擬定畢業(yè)論文提綱的意義和方法指導(dǎo)03-26
垃圾無(wú)害化再生意義和方法分析03-07
ARP病毒的攻擊原理分析03-14