大鼠腦干DVC區(qū)注射ghrelin對弓狀核NPY mRNA及AgRP mRNA表達的影
作者：陳新科 李清春 陳曦 蔣正堯 管洪在【摘要】 目的 探討腦干迷走神經(jīng)復合體(DVC)區(qū)微量注射ghrelin對攝食的影響及其可能機制。方法 72只雄性SD大鼠隨機分成給藥組和正常對照組，每組36只大鼠，行DVC區(qū)埋管手術，術后恢復7 d。7 d后給藥組大鼠DVC區(qū)微量注射20 pmol的ghrelin，正常對照組大鼠DVC區(qū)微量注射等體積生理鹽水。兩組分別于給藥后1、2、3 h取大鼠下丘腦提取RNA，應用熒光定量PCR方法檢測大鼠下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y（NPY）及刺鼠色蛋白相關蛋白（AgRP）mRNA的表達情況。結果 給藥組大鼠給藥后1、2、3 h下丘腦NPY mRNA和AgRP mRNA的表達水平均明顯高于正常對照組，差異有顯著性（t=2.79～9.12，P<0.05）。給藥組大鼠給藥后2 h下丘腦NPY mRNA和AgRP mRNA的表達水平明顯高于給藥后1 h及3 h組（F=16.55、10.45，q=3.89～4.45,P<0.05)，但給藥后1 h與3 h下丘腦NPY mRNA和AgRP mRNA的表達水平比較差異無顯著性(P>0.05)。結論 作用于大鼠DVC區(qū)的ghrelin可能通過下丘腦弓狀核NPY、AgRP神經(jīng)通路促進攝食活動。
【關鍵詞】 Ghrelin；下丘腦；弓狀核；神經(jīng)肽Y；刺鼠色蛋白相關蛋白；大鼠
hrelin是生長素促分泌素受體（GHS?R）的內(nèi)源性配體，由28個氨基酸組成，在飲食的控制中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，外周和腦室注射ghrelin都可使攝食量明顯增加。盡管GHS?R分布在腦中樞的多個區(qū)域,但目前絕大多數(shù)研究認為，無論中樞還是外周ghrelin促進攝食作用都是通過下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y（NPY）、 刺鼠色蛋白相關蛋白（AgRP）神經(jīng)元上的GSH?R介導的[1]。KIMBERL等[2]在大鼠第三腦室和第四腦室注射ghrelin后明顯地增加了下丘腦弓狀核NPY的表達，但是第三腦室和第四腦室相互交通，注射在任何一個腦室的藥物均有可能彌散到另一個腦室，從而影響結果的分析。最近ZIGMAN等[3]用原位雜交法的研究結果表明，在大鼠迷走神經(jīng)復合體（DVC）區(qū)的3個組成部分：孤束核、迷走神經(jīng)運動背核和最后區(qū)均有GHS?R的表達。FAUL?CONBRIDGE等[4]在大鼠右側DVC區(qū)注射10 pmol ghrelin獲得相當于下丘腦弓狀核注射30 pmol的攝食增加反應，提示在中樞ghrelin誘發(fā)的多食反應中，DVC可能和下丘腦弓狀核同樣重要。本文采用熒光定量PCR的方法檢測大鼠DVC區(qū)微量注射ghrelin 后下丘腦NPY mRNA及AgRP mRNA表達的變化，進而探討腦干DVC區(qū)微量注射ghrelin促進攝食的可能機制�，F(xiàn)將結果報告如下。
1 材料和方法
1.1 動物與分組
健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量250～350 g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。隨機分成給藥組和正常對照組，每組又根據(jù)注射后檢測間隔時間的不同分為3個亞組，即1 h組、2 h組和3 h組，每個亞組12只大鼠。給藥組大鼠DVC區(qū)埋管后微量注射20 pmol ghrelin，正常對照組DVC區(qū)以相同方法埋置套管，微量注射等體積生理鹽水。
1.2 主要試劑與儀器
Ghrelin 購自美國肽公司（American Peptide Company, INC），生理鹽水溶解。TRIzol 購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司。 SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自TOYOBO公司。熒光定量PCR儀為ABI 7500。立體定位儀為日本Narishige公司生產(chǎn)。紫外線分光光度計為Eppendorf Biophotometer公司生產(chǎn)。引物由上海生工合成，序列如下：內(nèi)參照β?actin 上游引物5′?CCATCCAGGCTGTGTTGTCC?3′，下游引物5′?GCTTCTCTTTAATGTCACGCACG?3′；PCR產(chǎn)物長度為243 bp。NPY 上游引物5′?TGTGGACTG?ACCCTCGCTCTAT?3′，下游引物5′?TGTAGTGT?CGCAGAGCGGAGTA?3′；PCR產(chǎn)物長度為139 bp。AgRP上游引物5′?AGCTTTGGCAGAGGTGCTA?GATC?3′，下游引物5′?TGCCAGTACCTAGCTTGCGG?3′；PCR產(chǎn)物長度為173 bp。
1.3 實驗方法
1.3.1 DVC區(qū)埋置套管 SD大鼠在(22±1)℃室溫下，保持12 h白天、12 h黑夜循環(huán)的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水和進食。手術當天，大鼠用80 g/L水合氯醛(400 mg／kg)腹腔麻醉，俯臥位，固定在立體定位儀上，頭部正中切口，剝離骨膜，使前后囟位于同一水平面。用三棱針在顱骨表面鉆孔，清除腦膜，參照大鼠腦圖譜[5]，將長15 mm、內(nèi)徑0.3 mm、外徑0.4 mm的自制不銹鋼套管垂直置入右側DVC區(qū)(前囟后13.8 mm，正中線旁開0.4 mm，顱骨表面下8.5 mm)，將一小螺絲釘固定于顱骨表面，用502膠和自凝牙托粉固定套管，并置入不銹鋼內(nèi)芯防止阻塞[6]。
1.3.2 埋管位置鑒定 分組實驗前先行埋管位置準確性的鑒定。大鼠手術后恢復7 d，分籠飼養(yǎng)，每天腹腔注射2萬單位青霉素預防感染。經(jīng)套管微量注射0.2 μL 滂胺天藍，然后心臟灌流生理鹽水和40 g/L甲醛后，取腦，以40 g/L 蔗糖?甲醛溶液固定，50 μm冠狀冷凍切片，觀察DVC置管定位準確性。重復此實驗，直至連續(xù)8只大鼠均能準確定位。
1.3.3 RNA的提取 大鼠手術后恢復7 d，給藥組大鼠微量注射20 pmol ghrelin，2 min內(nèi)注完，留針10 min；正常對照組同樣方法給予等體積生理鹽水。給藥和測定均在每天的上午10：00開始，實驗前3 d即開始模擬注射操作，以減少應激反應。所有動物均自由攝食。給藥后1、2、3 h分別取大鼠下丘腦，用Trizol Reagent常規(guī)方法提取總RNA，Eppendorf紫外線分光光度計測定RNA濃度和純度，并進行8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA完整性。
1.3.4 cDNA合成和熒光定量PCR反應 取5 μg總RNA，以Oligo dT為引物，按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA備用。定量PCR前將樣品稀釋1 000倍，反應體系為25 μL，含cDNA 2.5 μL,SYBR Green Mix 12.5 μL,10 μmol/L 上下游引物各1 μL,RNase?free Water 8 μL。反應條件：95 ℃60 s預變性；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s共40個循環(huán)。
1.3.5 熒光定量PCR結果的計算 △△ct=（目的ct值-內(nèi)參照ct值）-（目的ct值校正數(shù)-內(nèi)參照ct值校正數(shù)），然后取2-△△ct作為樣品初始cDNA的相對量。ct值表示每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
1.4 統(tǒng)計學分析
采用PPMS 1.5[7]統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
給藥組和正常對照組大鼠下丘腦中均檢出了NPY mRNA、AgRP mRNA及內(nèi)參照基因的表達(圖1)。熔解曲線分析可見單峰值，排除了非特異性擴增(圖2)。給藥組大鼠給藥后1、2、3 h下丘腦NPY mRNA及AgRP mRNA的表達水平均明顯高于正常對照組（t=2.79～9.12，P<0.05）。給藥組大鼠給藥后2 h下丘腦NPY mRNA及AgRP mRNA的表達水平明顯高于給藥后1 h及3 h(F=16.55、10.45，q=3.89～4.45,P<0.05)，給藥后1 h與3 h下丘腦NPY mRNA及AgRP mRNA表達水平比較，差異無差異性(P>0.05)。見表1。 圖1 β?actin及NPY、AgRP的熒光定量PCR產(chǎn)物電泳圖（略）
M為DNA Maker；①、②實驗組NPY；③對照組NPY；④對照組AgRP；⑤⑥實驗組AgRP；⑦陰性對照
圖2 熔解曲線圖（略）
表1 DVC 區(qū)注射ghrelin后不同時間大鼠下丘腦NPY mRNA和AgRP mRNA表達比較（略）
與正常對照組比較，*t=2.79～9.12,P<0.05；與其他時間點比較，F(xiàn)=16.55、10.45，#q=3.89～4.45,P<0.05
3 討論
Ghrelin是由胃黏膜內(nèi)分泌X/A樣細胞釋放的GSH?R的內(nèi)源性配體，其第3位的絲氨酸被辛酰化,這一修飾是其發(fā)揮活性所必需的。除了可促進生長素釋放，ghrelin 還具有促進食欲，增加體質(zhì)量，參與體質(zhì)量和能量穩(wěn)態(tài)的長期調(diào)節(jié)等作用[8]。它是迄今所發(fā)現(xiàn)的在禁食狀態(tài)下分泌增多的胃腸激素，即在饑餓和餐前有一個分泌峰，而進食后血漿ghrelin水平下降, 攜帶一種“反映胃營養(yǎng)充載狀態(tài)的信息”傳入腦中樞調(diào)節(jié)能量代謝[9,10]，被稱為“攝食啟動因子或饑餓激素”。對ghrelin的研究有著重要的意義，它是第一個被發(fā)現(xiàn)的促進食欲、減少脂肪利用的全身性循環(huán)激素，和參與肥胖調(diào)控的leptin作用相反，且參與體質(zhì)量和能量穩(wěn)態(tài)的長期調(diào)節(jié)，是減肥瘦身藥物開發(fā)的作用靶點；ghrelin受體激動劑可用于治療神經(jīng)性厭食，研究ghrelin調(diào)節(jié)攝食的神經(jīng)內(nèi)分泌機制，可為防治肥胖提供有價值的資料。
絕大多數(shù)研究結果證實，ghrelin刺激攝食的作用靶點是下丘腦弓狀核NPY、AgRP神經(jīng)元[1]，這是ghrelin誘發(fā)多食反應的前腦機制，因為大約90%的NPY、AgRP神經(jīng)元表達GHS?R[11]。已有實驗證實，腦室或腹腔注射ghrelin均引起下丘腦弓狀核c?Fos和NPY mRNA、AgRP mRNA表達增加,ghrelin所誘導的飲食促進作用可以被抗NPY、AgRP抗體或NPY Y1受體拮抗劑所阻斷。低劑量ghrelin 弓狀核區(qū)注射可以很明顯地增加大鼠攝食量。近年來，ghrelin其他潛在作用位點的研究成為關注的焦點。已經(jīng)證實迷走神經(jīng)切除的大鼠ghre?lin的攝食促進效應消失，表明ghrelin可以通過作用于迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)纖維發(fā)揮作用。DVC是腹腔胃腸道機械和化學信息的傳入中樞的第一個換元站，迷走?迷走反射在此整合。下丘腦弓狀核AgRP神經(jīng)元和室旁核有雙向聯(lián)系，而DVC的上行纖維經(jīng)臂旁核終止于室旁核。DVC包括孤束核、迷走神經(jīng)運動背核和最后區(qū)。孤束核和最后區(qū)不但接受腹部迷走神經(jīng)的傳入，而且最后區(qū)屬位于第四腦室底部的室周器官，其毛細血管有很多窗孔，血?腦脊液屏障不完整，和弓狀核一樣是感受循環(huán)血液中ghrelin的理想部位。有充分理由認為，DVC是ghrelin誘發(fā)多食反應的作用靶點。
本實驗結果顯示，在SD大鼠DVC區(qū)微量注射20 pmol ghrelin后1、2、3 h，下丘腦NPY mRNA、AgRP mRNA的表達均明顯增加，表明DVC區(qū)與下丘腦NPY/AgRP神經(jīng)元通路是密切相關的。此外，本實驗結果還顯示，DVC區(qū)注射ghrelin后1 h發(fā)揮作用，在2 h左右達到最高峰，此后其作用漸漸消退。表明ghrelin誘發(fā)多食反應可能有兩條途徑：第一條是目前比較公認的“前腦機制”, 即ghrelin作用于下丘腦弓狀核NPY/AgRP 神經(jīng)元的 GHS?R； 第二條是ghrelin作用于腦干DVC的GHS?R，然后通過上行纖維引起下丘腦NPY mRNA 及AgRP mRNA的表達增加，且兩條途徑可以協(xié)同作用引起多食反應。
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