細(xì)胞培養(yǎng)中的微生物污染及防控對策的論文

　　細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。體外細(xì)胞污染可分為3類： 物理性、化學(xué)性、生物性污染[1].其中生物性污染常見且造成的后果也較為嚴(yán)重，培養(yǎng)的細(xì)胞一旦遭到微生物污染，將具有不可逆轉(zhuǎn)性，輕則污染細(xì)胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細(xì)胞，甚至整個實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，給科研工作帶來嚴(yán)重的損失和威脅。以下對細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的微生物污染及防控作以介紹。

　　1 細(xì)菌污染

　　細(xì)菌污染特點(diǎn)為污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌污染后，培養(yǎng)基1 ~ 2 d就會變渾濁，對細(xì)胞生長影響明顯[2],p H值改變[3].常見細(xì)菌種類為大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌等（ 革蘭陰性菌） 葡萄球菌等（ 革蘭陽性菌）[4-5],其中革蘭陽性菌較為多見[6],利用此特點(diǎn)可指導(dǎo)抗生素的應(yīng)用。污染主要來源實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員（ 實(shí)驗(yàn)服）、實(shí)驗(yàn)用具等[4].污染后的鏡下特點(diǎn)為： 胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰，從壁上脫落，污染較輕時可見小菌體在細(xì)胞間運(yùn)動[5].

　　疑細(xì)菌污染后，可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類； 有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物 的 培 養(yǎng) 液 接 種，也 可 取10 m L細(xì) 胞 懸 液 以100 rpm離心5 min,沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2 m L,置于37 ℃培養(yǎng)，24 h可得結(jié)果。確定污染后，若想進(jìn)行挽救可在細(xì)菌污染培養(yǎng)液中添加雙抗（ 青鏈霉素）、西司他丁鈉+亞胺培南消除細(xì)菌污染[4,7].

　　2 霉菌污染

　　霉菌污染特點(diǎn)為短期內(nèi)不會引起培養(yǎng)液的渾濁，可在培養(yǎng)液中形成白色或黃色漂浮物。污染的主要來源為實(shí)驗(yàn)人員（ 實(shí)驗(yàn)服）[5].污染后的鏡下特點(diǎn)為： 低倍鏡下可見乳白色的團(tuán)狀漂浮物，培養(yǎng)液無變化； 高倍鏡下可見明顯的菌絲，細(xì)胞活力變差，生長速度明顯變慢，甚至死亡[8].

　　疑有霉菌污染的細(xì)胞可離心后經(jīng)PAS染色進(jìn)行霉菌鏡檢，同時進(jìn)行霉菌培養(yǎng)以確定污染及鑒定霉菌種類[9].霉菌污染初期，在培養(yǎng)液中可見漂浮的菌絲，這時將污染的細(xì)胞培養(yǎng)液慢慢吸出，用Hanks液清洗細(xì)胞及瓶壁2 ~ 3次，加入含有以下抗生素的培養(yǎng)液，即青霉素100單位/m L,鏈霉素100單位/m L,兩性霉素10 mg /L,24 h后觀察換液，若仍有菌絲可重復(fù)上述步驟進(jìn)行處理，2 ~ 3次后就基本得到控制[8].但經(jīng)此種方式處理后對細(xì)胞的生長影響也較大。另有報(bào)道低速離心法可清除霉菌污染，方式簡單對細(xì)胞影響小[9].但建議一般出現(xiàn)霉菌污染，如果不是非常珍貴的細(xì)胞一般都是扔掉，而且連相關(guān)的容器都要做嚴(yán)格的處理。

　　3 支原體污染

　　支原體污染的特點(diǎn)為短期無變化，具有隱蔽性。它們可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常的感覺。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染而貌似正常的細(xì)胞做試驗(yàn)或生產(chǎn)，將會嚴(yán)重影響結(jié)果[1].污染的主要來源為血清[4].污染后鏡下特點(diǎn)： 在光鏡下�？梢姷郊�(xì)胞核及胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆�；蚩张輀10].

　　目前實(shí)驗(yàn)室檢查支原體污染的金標(biāo)準(zhǔn)為DNA熒光染色法結(jié)合直接培養(yǎng)法[11],主要輔助檢測方法有PCR法、顯 微鏡法等[12-16],其他方法有滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)[17]、瓜氨酸測定法[18]、免疫熒光抗體法、放射自顯影法[19]等。相對于其他污染的檢測，支原體污染的檢測方法雖多，但在價(jià)格及特異性方面差異很大，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。支原體的清除一般不宜用抗生素，因其對抗生素不敏感，主要的清除方法有抗血清處理法、高溫處理法、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞清除法、選擇性殺滅哺乳動物類細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體的方法，其中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞清除法效果較好，方法是將支原體污染的細(xì)胞注射到小鼠腹腔。經(jīng)24 h或48 h后，將小鼠腹水抽出（ 腹水已含注入的細(xì)胞） ,經(jīng)離心后收集細(xì)胞于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)[19].因在日常細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體的污染常被忽視，為了避免損失可 定 期 對 實(shí) 驗(yàn) 室 中 的 培 養(yǎng) 物 進(jìn) 行 支 原 體 檢測[20].

　　4 病毒污染

　　病毒污染特點(diǎn)是極為隱蔽，很難用常規(guī)的方法檢測到[21].受病毒污染的細(xì)胞液通常清亮無變化。污染分為外源性和內(nèi)源性[19,22],污染的主要來源為細(xì)胞系，常見于雜交瘤細(xì)胞[4].大多數(shù)受病毒污染的細(xì)胞不會產(chǎn)生形態(tài)變化及細(xì)胞病理現(xiàn)象[19],少部分病毒會造成細(xì)胞變圓、腫脹，脫落[21].

　　疑病毒污染后，可用血細(xì)胞吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒[19].通常病毒物污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細(xì)胞株。

　　5 黑膠蟲污染

　　黑蛟蟲是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界還有爭論。其污染特點(diǎn)為開始對細(xì)胞無影響，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定程度時就會對細(xì)胞產(chǎn)生影響[23].受黑蛟蟲污染的細(xì)胞液通常清亮無變化。污染主要來源于血清，400倍顯微鏡下可見點(diǎn)狀或片狀游動小體。

　　黑蛟蟲早期污染一般采用如下方法： 用0. 25%的胰酶消化，當(dāng)有少量細(xì)胞變圓或脫壁時，用血清終止消化，輕輕用培養(yǎng)基或D-Hanks液清洗3遍（ 緩慢流過細(xì)胞表面） ,不要吹打，然后吹散細(xì)胞，換培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔天換液。2 d后重復(fù)一次，以后每24 ~ 36 h換1次液，1周后，黑點(diǎn)可基本消失。也可用麥諾霉素10 mg /L處理，連續(xù)1周，但麥諾霉素對細(xì)胞有毒性[23].

　　6 細(xì)胞的交叉污染

　　細(xì)胞的交叉污染一般來自細(xì)胞建株和細(xì)胞傳代過程中兩種或兩種以上細(xì)胞之間的污染[19].鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，與正常該細(xì)胞株的形態(tài)不同。

　　關(guān)于細(xì)胞系的種系來源可以通過各種免疫學(xué)試驗(yàn)、同功酶分析及細(xì)胞遺傳學(xué)方法來確定。其中以熒光抗體染色法和同功酶譜系分析法應(yīng)用較廣泛。同功酶分析法不僅可以鑒別細(xì)胞種屬，而且可以鑒別種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染[19].若發(fā)生細(xì)胞的交叉污染，通常不能挽回，只能放棄細(xì)胞。為避免細(xì)胞的交叉污染，在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時發(fā)生混亂。在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞[23].

　　7 結(jié) 語

　　細(xì)胞一旦發(fā)生污染，任何一種挽救細(xì)胞的處理可能都會對細(xì)胞產(chǎn)生不良或未知的影響，因此如果不是不易獲得的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)者都應(yīng)該抱著嚴(yán)謹(jǐn)平和的態(tài)度重新開始。細(xì)胞培養(yǎng)中污染的來源主要有以下幾種途徑：1） 細(xì)胞組織本身帶有污染；2） 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣不潔凈；3） 實(shí)驗(yàn)操作者未能嚴(yán)格遵守操作規(guī)程；4） 生物安全柜不潔凈或使用不正確；5） 實(shí)驗(yàn)中所用的器具和培養(yǎng)基消毒不徹底。因此實(shí)驗(yàn)者應(yīng)從以上幾方面盡量避免細(xì)胞污染，才能保證實(shí)驗(yàn)的有序進(jìn)行。

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